عضو هیأت علمی و دانشیار گروه فن‌آوری‌های غذایی، پژوهشکده فن‌آوری‌های شیمیایی
سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران
تثبیت آنزیم‌ها و فواید آن
تثبیت یک تعریف عمومی از ایجاد انواع اتصالات یا محبوس‌کردن سلول‌ها و ذرات است که اساساً تمام انواع کاتالیزور‌های زیستی از جمله آنزیم‌ها، اندامک‌های سلولی و سلول‌های گیاهی و حیوانی را شامل می‌شود. دلایل متعددی برای تثبیت آنزیم وجود دارد. استفاده از آنزیم و کارکردن با آن راحت‌تر است، بعلاوه جداسازی آنزیم از محصول آسان‌تر شده و نیز می‌توان غلظت پروتئین در محصول را به حداقل رساند و یا به‌کلی حذف نمود. همچنین با تثبیت‌کردن آنزیم‌ها بازیافت کارآمد و آسان‌تر آنزیم امکان‌پذیر شده و از نظر اقتصادی به‌صرفه خواهد بود. پایداری به دناتوراسیون حرارتی و یا حلال‌های آلی و مقاومت در برابر اتولیز و افزایش پایداری ساختار آنزیم از فواید مهم آنزیم‌ها به‌شمار می‌رود. به‌طور خلاصه می‌توان مزایای تثبیت آنزیم‌ها را بدین شرح خلاصه نمود:
1- پایداری ساختار آنزیم‌ها تحت شرایط دشوار صنعتی
2- قابلیت جداسازی آسان آنزیم از محیط واکنش و استفاده مجدد از آن
3- از بین‌رفتن خطر آلودگی محیط واکنش با پروتئین آنزیم
4-کاهش هزینه تولید فرآورده نهایی
5- امکان استفاده از بیورآکتور‌های آنزیمی تثبیت شده با سیستم مداوم (Continuous).
روش‌های تثبیت آنزیم‌ها
1-جذب فیزیکی ( Physical adsorption )
یک روش ساده و قابل‌برگشت (reversible immobilization ) می‌باشد. با استفاده از اتصالات غیر اختصاصی ضعیف مانند ؛ Van der Waals، Hydrophobic interactions ، Hydrogen bonds بین مولکول آنزیم و ماده حامل صورت می‌گیرد.
شکل1. روش جذب فیزیکی در تثبیت آنزیم ها
2- روش به‌دام‌انداختن یا Entrapment
در این روش، آنزیم درون حفره‌ها و یا غشاء‌های پلیمری (هیدروکلوئیدها) محبوس گردیده و حرکت آزاد خود را از دست می‌دهد. این روش تثبیت غیر‌قابل‌برگشت (irreversible) بوده و احتباس فیزیکی آنزیم در یک فضا یا شبکه مشخص، و قابل‌نتقال برای سوبسترا و محصول تولید‌شده صورت می‌گیرد. در این روش پایداری ساختار آنزیم افزایش یافته و خروج آنزیم از محیط واکنش صورت نمی‌گیرد. روش Microencapsulation هم در این بخش قرار می‌گیرد.
شکل 10. آنزیم محبوس شده درون حفره احتباس
شکل2. روش احتباس در تثبیت آنزیم‌ها
3- روش تثبیت بدون ماده حامل ( Cross-linking )
روش تثبیت بدون حامل (carrier-free immobilization) اتصال مولکول‌های آنزیم به یکدیگر از طریق اسید آمینه لیزین در سطح مولکول، با استفاده از یک معرف اتصال دهنده Crosslinker)) مانند گلوتارآلدئید می‌باشد. در این روش 2 نوع تثبیت انجام می‌شود:
شکل3. شمای ایجاد اتصال جانبی بدون ماده حامل بین مولکول های آنزیم
(Cross-linked Enzyme Aggregates= CLEAs)
(Cross-linked Enzyme Crystals= CLECs)
4- روش تثبیت به‌صورت ایجاد اتصال کووالانت (Covalent bonding )
یکی از متدهای رایج (irreversible ) در تثبیت آنزیم‌ها است. آنزیم با ماده حامل از طریق گروه‌های واکنش‌دهنده از مولکول آنزیم واکنش‌داده و تثبیت صورت می‌گیرد. گروه‌های واکنش‌دهنده شامل گروه‌های عاملی اسید‌های آمینه مانند group) (ε-amino لیزین ، (thiol group) سیستئین ، (carboxylic group)آسپارتیک و گلوتامیک اسید ، (imidazole) هیستیدین ، و (phenolic) تیروزین می‌باشند.
شکل4. شماتیک تثبیت آنزیم ها با روش ایجاد اتصال کووالانت
5- روش Affinity immobilization
در این روش ماده حامل حاوی ترکیباتی است که تمایل ویژه‌ای برای ایجاد کمپلکس با آنزیم دارد. به‌همین دلیل coupled affinity ligand (ماده کمپلکس‌دهنده با جاذبه ویژه) موجب تثبیت آنزیم می‌گردد.
شکل5. شماتیک تثبیت آنزیم با روش Affinity immobilization
6- Magnetic Nanoparticles Immobilization Method
نانوذرات دارای اندازه 100-1 نانومتر هستند. نانوذرات مغناطیسی به‌عنوان یک حامل بسیار کارآمد برای تثبیت آنزیم‌ها عمل می‌کنند . دارا‌بودن سطح اختصاصی برای اتصال به آنزیم ، انتقال جرم مناسب و با کارایی بالا ، اتصال مقادیر بالایی از آنزیم به حامل (Enzyme Loading) ، جداسازی آنزیم از محیط واکنش با استفاده از میدان مغناطیسی جزء مزایای این روش است. در روش تثبیت آنزیم روی نانوذرات مغناطیسی، نانو ذرات مغناطیسی Fe3O4 تهیه می‌گردد.
- فعال کردن سطح (Functionalization) نانوذرات مغناطیسی Fe3O4 با گروه‌های عاملی مختلف صورت می‌گیرد.
شکل6. انواع اتصالات نانو ذرات مغناطیسی Fe3O4 با آنزیم‌ها
شکل7. فعال‌کردن سطح (Functionalization) نانوذرات مغناطیسی با ترکیبات آلی
شکل8. پوشش دادن سطح نانوذرات مغناطیسی با آنزیم و تثبیت آنزیم
بحث و نتیجه‌گیری
بسیاری از این روش‌ها جهت تثبیت آنزیم‌های استخراج‌شده از اکستریموفیل‌ها مورد استفاده قرار گرفته و در صنایع مختلف به‌کار می‌روند.
